Τι είναι μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (pcr); τα στοιχεία σχετικά με τη δοκιμή, τα βήματα & χρησιμοποιούνται για

Τι είναι η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης);

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση ιχνών DNA (και σε μερικές περιπτώσεις, RNA) που βρίσκονται σε ή σχεδόν σε οποιοδήποτε υγρό ή επιφάνεια όπου μπορούν να εναποτεθούν ϋΝΑ κλώνοι. Το κλειδί για την κατανόηση της PCR είναι να γνωρίζουμε ότι κάθε ανθρώπινο, ζωικό, φυτικό, παράσιτο, βακτήριο ή ιός περιέχει γενετικό υλικό όπως αλληλουχίες DNA (ή RNA) (αλληλουχίες νουκλεοτιδίων ή κομμάτια DNA ή RNA) που είναι μοναδικά στο είδος τους, και στο μεμονωμένο μέλος αυτού του είδους. Συνεπώς, αν ένα δείγμα περιέχει τμήματα DNA ή RNA, η PCR είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για να ενισχύσει (κάνει πολύ περισσότερα ταυτόσημα αντίγραφα) αυτών των μοναδικών αλληλουχιών, ώστε να μπορούν στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για να προσδιορίσουν με πολύ μεγάλη πιθανότητα την ταυτότητα της πηγής συγκεκριμένο άτομο, ζώο ή παθογόνο οργανισμό) του ίχνους DNA ή RNA που ευρίσκεται εντός ή επί σχεδόν οποιουδήποτε δείγματος υλικού.

Εντούτοις, η ενίσχυση PCR είναι μόνο μέρος της δοκιμής ταυτοποίησης. Μόλις γίνει η ενίσχυση (βλέπε παρακάτω), τα ενισχυμένα τμήματα πρέπει να συγκριθούν με άλλα τμήματα νουκλεοτιδίων από μια γνωστή πηγή (για παράδειγμα, ένα συγκεκριμένο άτομο, ζώο ή παθογόνος οργανισμός). Αυτή η σύγκριση μοναδικών τμημάτων γίνεται συχνά με την τοποθέτηση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που παράγονται με PCR δίπλα σε γνωστές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων από ανθρώπους, παθογόνα ή άλλες πηγές σε ένα διαχωριστικό πήκτωμα. Το ηλεκτρικό ρεύμα τρέχει μέσω του πηκτώματος και οι διάφορες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων σχηματίζουν ζώνες που μοιάζουν με «σκάλα» σύμφωνα με το ηλεκτρικό τους φορτίο και το μοριακό τους μέγεθος. Αυτό ονομάζεται ηλεκτροφόρηση πηκτής. Ζώνες ή "σκάλα" όπως τα βήματα που μεταναστεύουν στα ίδια επίπεδα στο πήκτωμα δείχνουν την ταυτότητα των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Αυτή η μέθοδος είναι ένας από τους πιο δημοφιλείς τρόπους που έχουν ολοκληρωθεί οι δοκιμές PCR (βλ. Σχήμα 1).

Σχήμα 1, Ζώνες ή "σκάλα" όπως τα βήματα της PCR που παρήγαγε το DNA του Mycobacterium (ευγενική προσφορά του CDC)

Φιγούρα. Στοιχεία επαναλαμβανόμενων στοιχείων (Rep) -PCR (A) και ηλεκτροφόρησης πηκτής παλμικού πεδίου (PFGE) (Β) απομονώσεων Mycobacterium cosmeticum από 2 ασθενείς στο Οχάιο και 1 ασθενή στη Βενεζουέλα. Η Rep-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του εκκινητή BOXA1R (3) και διεξήχθη PFGE με περιοριστικό ένζυμο AseI. Οι λωρίδες 1, 2, Ohio απομονώνονται ΟΗ1 και ΟΗ2. διαδρομές 3, 4, στελέχη ελέγχου ΑΤΟΟ ΒΑΑ-878Τ και ΑΤΟΟ ΒΑΑ-879. λωρίδα 5, προϊόν απομόνωσης VZ1 της Βενεζουέλας. Τα πρότυπα μεγέθους DNA είναι δείκτες 100 bp (S1) και 48, 5 kb (S2).

Πώς γίνεται η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης);

Το 1983, ο Kary Mullis κατέγραψε τα βασικά βήματα για την ενίσχυση των ακολουθιών DNA. Αυτός και ο Michael Smith απονεμήθηκαν το βραβείο Νόμπελ για την ανάπτυξη αυτής της διαδικασίας το 1993. Υπάρχουν μερικά βασικά βήματα που ακολουθούνται σε σειρά. Η PCR μπορεί να γίνει σε ένα μόνο σωλήνα με κατάλληλα χημικά και μια ειδικά σχεδιασμένη θερμάστρα. Τα απαιτούμενα αντιδραστήρια ή χημικά προϊόντα είναι τα ακόλουθα:

• Ένα δείγμα που περιέχει αλληλουχία νουκλεοτιδίων (από αίμα, μαλλιά, πύον, απόξεση δέρματος κ.λπ.)
• DNA εκκινητές: σύντομο μονόκλωνο ϋΝΑ που προσδένεται σε αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που προάγει τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου νουκλεοτιδίων
• DNA πολυμεράση: ένα ένζυμο που, όταν το DNA έχει δεσμευμένο εκκινητή, πηγαίνει προς τα κάτω στο τμήμα DNA που συνδέει δομικά στοιχεία DNA για να σχηματίσει συμπληρωματικά ζεύγη βάσεων και έτσι συνθέτει έναν συμπληρωματικό νουκλεοτιδικό κλώνο DNA (εισαγωγή μιας ανθεκτικής στη θερμότητα ϋΝΑ πολυμεράσης, Taq πολυμεράση, που προέρχεται από ανθεκτικά στη θερμότητα βακτήρια, βελτίωσε σημαντικά την ικανότητα εκτέλεσης PCR)
• Μια μεγάλη περίσσεια δομικών λίθων DNA που ονομάζονται νουκλεοτίδια (αδενίνη, θυμιδίνη, κυτοσίνη και γουανίνη, συντομογραφημένα ως: Α, Τ, C και G, αντίστοιχα) υπάρχουν στο διάλυμα. Όταν αυτά τα μπλοκ συνδέονται μεταξύ τους, σχηματίζουν μια αλληλουχία νουκλεοτιδίων ή έναν μόνο κλώνο DNA. Όταν τα δομικά αυτά δεσμά δεσμεύουν το συμπληρωματικό οικοδομικό τους σώμα με αδύναμους δεσμούς υδρογόνου (για παράδειγμα, το Α θα δεσμεύεται μόνο με Τ και G μόνο με το C) σχηματίζεται συμπληρωματική αλληλουχία νουκλεοτιδίων DNA και δεσμεύεται στο αρχικό μονόκλωνο DNA. Όταν ολοκληρωθεί η σύνδεση, σχηματίζεται συμπληρωματικό ϋΝΑ διπλής έλικας σε συγκεκριμένη αλληλουχία.

Η PCR, τότε, αρχίζει με ένα τμήμα DNA από ένα δείγμα που τοποθετείται σε ένα σωληνάριο με τα προαναφερθέντα αντιδραστήρια. Το διάλυμα θερμαίνεται τουλάχιστον στους 94 ° C (201, 2 F). αυτή η θερμότητα σπάει τους δεσμούς υδρογόνου που επιτρέπουν τη δημιουργία συμπληρωματικών ρευμάτων DNA, έτσι ώστε στο μείγμα υπάρχουν μόνο μονές αλυσίδες (αυτό ονομάζεται μετουσίωση του δίκλωνου DNA).

Το μίγμα αφήνεται να ψυχθεί στους περίπου 54 ° C (129, 2 F). Σε αυτή τη θερμοκρασία, οι εκκινητές ϋΝΑ και η ϋΝΑ πολυμεράση συνδέονται με ξεχωριστό μονόκλωνο ϋΝΑ (αυτό ονομάζεται ανόπτηση του ϋΝΑ). Επειδή τα δομικά στοιχεία βρίσκονται σε περίσσεια (υψηλή συγκέντρωση) στο μείγμα, η πολυμεράση τα χρησιμοποιεί για να δημιουργήσουν νέες συμπληρωματικές αλυσίδες DNA (ονομάζεται επέκταση του DNA) και αυτή η διαδικασία είναι ταχύτερη στους 72 ° C (161, 6 F). Αυτή η διαδικασία δημιουργεί ένα νέο μόριο διπλού κλώνου DNA από κάθε μία από τις μονές αλυσίδες του αρχικού μορίου.

Αυτός ο κύκλος επαναλαμβάνεται περίπου 40 φορές σε μια μηχανή που ονομάζεται θερμικός ανακυκλωτής που επαναλαμβάνει αυτόματα τους κύκλους θέρμανσης-ψύξης, ενώ η ποσότητα κάθε ακολουθίας ϋΝΑ διπλασιάζεται κάθε φορά που ολοκληρώνεται ο κύκλος θέρμανσης-ψύξης. Αυτό που αρχικά ήταν ένα μόνο μικρό τμήμα του DNA μπορεί να ενισχυθεί σε περίπου 100 δισεκατομμύρια αντίτυπα μετά από 40 κύκλους διπλασιασμού.

Γιατί ένας γιατρός θα διατάξει μια PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης);

Η δοκιμή PCR αποτελεί τη βάση ενός αριθμού εξετάσεων που μπορούν να απαντήσουν σε πολλά διαφορετικά ιατρικά ερωτήματα που βοηθούν τους γιατρούς να διαγνώσουν και να θεραπεύσουν τους ασθενείς. Για παράδειγμα, οι δοκιμές PCR μπορούν να ανιχνεύσουν και να αναγνωρίσουν παθογόνους οργανισμούς σε ασθενείς, ιδιαίτερα εκείνους που είναι δύσκολο να καλλιεργηθούν (για παράδειγμα, HIV και άλλοι ιοί και ορισμένοι μύκητες).

Άλλοι γιατροί διατάζουν PCR δοκιμές για να βοηθήσουν στη διάγνωση γενετικών ασθενειών, ενώ άλλοι γιατροί χρησιμοποιούν PCR για την ανίχνευση βιολογικών σχέσεων, όπως η αναγνώριση γονέων παιδιών. Οι δοκιμές PCR χρησιμοποιούνται επίσης για τον εντοπισμό και το χαρακτηρισμό γενετικών μεταλλάξεων και αναδιατάξεων που εντοπίζονται σε ορισμένους τύπους καρκίνου.

Ωστόσο, οι δοκιμές PCR έχουν τροποποιηθεί και επεκταθεί σε πολλές πτυχές των επιστημονικών ερευνών, συμπεριλαμβανομένης της εξελικτικής βιολογίας, των γενετικών δακτυλικών αποτυπωμάτων, των εγκληματολογικών ερευνών και πολλών άλλων.

Τι είναι RT-PCR;

Η RT-PCR είναι μια δοκιμή PCR που έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση και τη μέτρηση του RNA. Αν και οι αρχικές δοκιμές PCR ενίσχυσαν το DNA, πολλοί ιοί και άλλα βιολογικά συστατικά (για παράδειγμα, μιτοχόνδρια) χρησιμοποιούν το RNA ως γενετικό τους υλικό. Η RT-PCR διαφέρει από τη συμβατική PCR με την πρώτη λήψη του RNA και τη μετατροπή του κλώνου RNA σε έναν κλώνο DNA. Αυτό γίνεται ουσιαστικά με την ίδια μέθοδο για την PCR που περιγράφεται παραπάνω με την εξαίρεση της χρήσης ενός ενζύμου που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση αντί της ϋΝΑ πολυμεράσης. Η αντίστροφη μεταγραφάση επιτρέπει σε ένα μοναδικό κλώνο RNA να μεταφραστεί σε έναν συμπληρωματικό κλώνο DNA. Μόλις συμβεί αυτή η αντίδραση, η ρουτίνα μέθοδος PCR μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση του DNA. Η RT-PCR έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση και τη μελέτη πολλών ιών RNA.

Η RT-PCR δεν πρέπει να συγχέεται με άλλη παραλλαγή της PCR, που ονομάζεται PCR πραγματικού χρόνου. Η PCR σε πραγματικό χρόνο είναι μια παραλλαγή της PCR που επιτρέπει την ανάλυση του ενισχυμένου DNA κατά τη διάρκεια των συνήθων 40 κύκλων της διαδικασίας. Αν και η διαδικασία είναι παρόμοια με τη συμβατική PCR με ποδήλατο, η Real-Time PCR χρησιμοποιεί φθορίζουσες χρωστικές που είναι προσαρτημένες σε μερικές από τις δομικές μονάδες ή μικρές νουκλεοτιδικές αλυσίδες. Ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο, ο φθορισμός εμφανίζεται όταν σχηματίζονται οι ενισχυμένοι κλώνοι DNA. Η ποσότητα του φθορισμού μπορεί να μετρηθεί σε όλους τους 40 κύκλους και επιτρέπει στους ερευνητές να μετρήσουν συγκεκριμένα προϊόντα και τις ποσότητες τους κατά τη διάρκεια των κύκλων ενίσχυσης. Αυτό συχνά επιτρέπει στους ερευνητές ή στους τεχνικούς εργαστηρίων να παραλείπουν την ηλεκτροφόρηση πηκτής ή άλλες δευτερογενείς διαδικασίες που απαιτούνται για την ανάλυση των προϊόντων PCR, παράγοντας έτσι πιο γρήγορα αποτελέσματα.

Η PCR σε πραγματικό χρόνο και η RT-PCR είναι παραλλαγές ή τροποποιήσεις του αρχικού τεστ PCR. Ωστόσο, υπάρχουν πολλές περισσότερες παραλλαγές (τουλάχιστον 25) που υπάρχουν και χρησιμοποιούνται για την επίλυση συγκεκριμένων προβλημάτων. Όλοι έχουν διαφορετικά ονόματα, όπως PCR Συναρμολόγησης, PCR Hot-Start, Πολλαπλή PCR, PCR Στερεάς φάσης και πολλά άλλα.

Η PCR πιθανόν να συνεχίσει να τροποποιείται για να βοηθήσει να απαντήσει σε οποιεσδήποτε άλλες ερωτήσεις στην ιατρική, τη βιολογία. και άλλους τομείς σπουδών.